1.形态和培养特征观察 　　采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导 　　2.生长条件试验 　　(1)耐盐性试验(NaCl浓度:0.85、1.20和1.71)(mol/L); 　　(2)耐酸碱试验(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7); 　　(3)温度梯度试验(温度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃)。 　　分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48h,记录生长状况。 　　3.生理生化试验 　　⑴过氧化氢酶测定 　　将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。 　　⑵葡萄糖产酸产气实验 　　在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂,在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h,经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。 　　⑶淀粉水解实验 　　接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。 　　⑷明胶液化实验 　　将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应 　　⑸甲基红（M.R）试验 　　接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。 　　⑹乙酰甲基甲醇V-P实验 　　接种新鲜的实验菌种于培养基中,37℃培养2天后,取培养液1mL在其中 　　加入1ml10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性 　　⑺柠檬酸盐 　　取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性 　　⑻酪素水解试验 　　牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固 　　⑼厌氧生长测定 　　将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性 　　(10)厌氧硝酸盐产气 　　接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。 　　观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。 　　(11)石蕊牛奶的反应 　　牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况 　　(12)糖发酵实验 　　将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱. 　　附一些培养基： 　　①PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl20.2g,MgSO420.0g,K2HPO41.0g,,KH2PO41.0g,NaHCO310.0g,NaCl2.0g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃) 　　②PYG培养基:PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖 　　③营养明胶蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.0；加热溶解、校正至pH7.4～7.6，分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8～7.0 　　④柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠3gNH4H2PO41gMgSO40.2g 　　K2HPO41gNaCl5g琼脂15—20g水1000mL加热溶解后，调pH至7，再加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色，分装试管，每管5mL，121灭菌30min 　　⑤含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤 　　4.16SrDNA序列分析 　　这个LZ另外查好了，很多学问。 　　5.生长曲线 　　活菌计数方法：采用涂布法,进行菌落计数，每隔一段时间（2-4小时）测