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双向电泳第二步SDS-PAGE跑胶的问题主要有2个问题:第一:跑出来的胶有很多的横着竖着的条带,不知道是蛋白没有分开还是怎么的.看Bio-Rad上面写的问题分析说可能是蛋白被污染了,所以加了DNA
3人问答
更新时间:2024-04-26 05:45:35
问题描述:

双向电泳第二步SDS-PAGE跑胶的问题

主要有2个问题:

第一:跑出来的胶有很多的横着竖着的条带,不知道是蛋白没有分开还是怎么的.看Bio-Rad上面写的问题分析说可能是蛋白被污染了,所以加了DNAseI和RNaseA在最开始的蛋白里面,不过效果还是不好,依然有很多条带.

第二:把第一条strip放在成品胶(SDS-PAGE的那个胶)顶部,用琼脂(agarose)凝固了2个小时,然后再跑SDS-PAGE.跑前这块成品胶都好好的,但是跑完胶(2个小时)以后,成品胶就连同上面的strip一起被挤出了原来的槽子.有朋友说可能是跑胶的时候温度太高,让胶胀大了.我就把胶放在4度的冷冻室里面跑,但是成品胶还是被挤出来了,这样会影响从strip里面转到成品胶的蛋白量.

孟书苹回答:
  1,提取蛋白的时候要充分超声粉碎,然后高速离心.吸取上清的时候不要触到沉淀.污染不一定是RNA和DNA,还有可能是胶里面有杂质.   2.遇热膨胀过度,你可以在电泳槽里面安放冰槽,电泳液预先降温,同时降低电泳时的电流.还有配琼脂也要用缓冲液,而不是水,不然不导电.接触不好也会引起条带变形
施云波回答:
  我要的蛋白分子量大概是40K-130K的,那应该用多少g离心比较好呢?我是在120V下面跑了2个小时,4度的环境,没有单独设置电流,那应该用多大的电流比较好?琼脂是买的Bio-Rad的商品琼脂,好像也没办法单独加缓冲液。刚刚你这么一说,我突然想到我的琼脂是热到73度左右就直接加在胶上面了,是不是这个温度不合适?那应该用什么温度啊?多谢了!
孟书苹回答:
  一般离心12000xg,10分钟120v2小时,肯定要升温的。可以多试几个,降低电压,延长时间。琼脂买回来是粉吧,配置的时候要加缓冲液,而不是水来加热融化。如果买的是冻结的琼脂,要保证充分加热溶解,知道没有肉眼可见的颗粒才行。加热的温度不用担心,反正要等冷了才跑的
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